科研产出
重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立
《云南农业大学学报(自然科学版) 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型（fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术（recombinase aided amplification,RAA）与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a）技术相结合，针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA （crRNA），利用RAA技术扩增样本核酸，并进行CRISPR-Cas13a荧光检测，以qPCR为对照方法，评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成，反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10~1 copies/μL，灵敏度高，且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点，可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。
关键词： 禽腺病毒4型 CRISPR/Cas13a 重组酶辅助扩增 检测
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猪流行性腹泻病毒N-E.coli OmpA融合基因构建、表达及其免疫原性评价
《养猪 》 2022
摘要：为获得免疫原性更强的猪流行性腹泻病毒（PEDV）结构蛋白，试验将PEDV N蛋白基因和大肠杆菌（E.coli）OmpA蛋白基因进行融合，采用柔性linker联接，得到OmpA-linkerPEDV N融合基因，并克隆至pCold I质粒，构建重组质粒p Cold I-OmpA-linker-PEDV N。重组质粒转入BL21感受态细胞，SDS-PAGE分析重组质粒的表达，并对其编码的融合蛋白进行二级和三级结构预测。Western-blot和ELISA分析融合蛋白的免疫原性。结果表明：构建了融合基因表达质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N，表达了约88 ku的融合蛋白；融合蛋白的二级结构未发生明显变化，三级结构预测可折叠为正确的空间构像。该融合蛋白同时具有PEDV N蛋白和OmpA蛋白的免疫原性，并且其免疫原性显著高于单一PEDV N蛋白。说明试验获得了免疫原性较好的融合基因表达蛋白，可以为PEDV N蛋白功能研究、特异性抗体制备以及PEDV亚单位疫苗的研制提供材料和研究基础。
关键词： PEDV N基因 E.coli OmpA基因 基因融合 基因表达 免疫原性
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番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析
《中国兽医杂志 》 2022 北大核心
摘要：为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征,本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因,并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对.序列分析显示,克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因,分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高,而NS基因则较为保守;进化分析显示,安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支,二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近,可能来源于同一毒株,与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远;安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致.两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高,与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH 1401同源性也在99.5%以上;与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低,其中VP基因仅为88.9%、89.3%.本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高,但仍存在一定程度的基因变异,增加了诊断与防控该病的难度.
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鸡白痢沙门菌感染雏鸡的骨髓miRNA表达谱分析
《畜牧兽医学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：旨在探究鸡白痢沙门菌（Salmonella enterica serovar Pullorum,S. Pullorum）感染雏鸡后骨髓miRNA的差异表达特征，为深入了解鸡白痢沙门菌的致病机制提供理论基础。将7日龄SPF雏鸡随机分为两组，分别口服鸡白痢沙门菌和PBS,于感染24 h后采集骨髓进行miRNA测序，筛选差异倍数≥2且P值≤0.05的差异表达miRNAs进行靶基因预测以及GO、KEGG富集分析，随机选取6个miRNAs进行qRT-PCR验证，构建与免疫过程相关的miRNA-mRNA靶点网络。通过miRNA测序，共获得20个已知的差异表达miRNAs,其中11个上调，9个下调。qRT-PCR结果表明，miRNA变化趋势与测序结果一致。GO分析结果表明，差异表达基因主要富集在膜运输、信号转导、免疫系统、碳水化合物代谢、糖类的生物合成和代谢等，KEGG的信号通路主要富集在Notch信号通路、Hedgehog信号通路、PPAR信号通路、AMPK信号通路、Hippo信号通路等，miRNA-mRNA网络互作发现，gga-miR-1466和gga-miR-6643-5p可能是参与免疫过程相关的关键miRNA。本研究解析了鸡白痢沙门菌感染雏鸡的骨髓miRNA表达谱特征，为了解鸡白痢沙门菌和鸡之间相互作用的复杂分子致病机制提供了新的见解，为防控鸡白痢沙门菌感染提供了新策略。
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复方中药发酵饲料对母猪繁殖性能、血清生化指标和肠道菌群的影响
《中国畜牧杂志 》 2021 北大核心
摘要：为研究复方中药发酵饲料对母猪繁殖性能、血清生化指标和肠道微生物菌群的影响,本试验选取20头经产母猪分为对照组和试验组,每组10头。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中加入20%的复方中药发酵饲料。对试验组和对照组的平均窝产活仔数、平均窝产弱仔率和仔猪腹泻率进行分析;在第0、15、30天测定2组母猪的血清生化指标,在第15天采集母猪粪便样品,测定微生物菌群变化。结果显示:与对照组相比,试验组母猪的平均窝产活仔数增加（P>0.05）,平均窝产弱仔率（P>0.05）和仔猪平均腹泻率（P<0.05）降低;与对照组相比,试验组血清总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶和过氧化氢酶含量在第15天和30天均升高（P<0.01）;试验组血清丙二醛、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量在第15天和30天均显著或极显著低于对照组;饲喂复方发酵中药饲料可提高母猪的肠道微生物多样性和稳定性（P>0.05）,并且可显著提高克里斯滕森氏菌属R-7群、乳杆菌属、瘤胃菌科UCG-002、拟杆菌属等有益菌的相对丰度,显著降低密螺旋体属2、链球菌属、副拟杆菌属和大肠杆菌-志贺氏菌属等菌群的丰度。综上所述,饲喂复方中药发酵饲料可提高母猪的繁殖性能,提高机体抗氧化能力,改善母猪的肠道菌群结构。
关键词： 复方中药发酵饲料 母猪 繁殖性能 血清生化指标 肠道菌群
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GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立
《安徽农业科学 》 2021
摘要：[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）和禽腺病毒血清4型（FAdV-4）3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒（DFV）、鸭I型肝炎病毒（DVH-Ⅰ）和禽呼肠孤病毒（ARV）;GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。
关键词： 鹅细小病毒（GPV） 番鸭细小病毒（MDPV） 禽腺病毒4型（FAdV-4） 三重PCR检测
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复方中药发酵饲料对母猪血清生化指标和免疫机能的影响
《养猪 》 2021
摘要：为研究复方中药发酵饲料对母猪血清生化指标和免疫机能的影响,研究选取20头经产母猪随机分为对照组和试验组,每组10头,对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中加入20%的复方中药发酵饲料。在第0天、第15天和第30天分别采集两组母猪的血清,测定血清生化指标和免疫指标。结果显示,与对照组相比,试验组血清总抗氧化能力（T-AOC）极显著升高（P<0.01）;血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量在第15天和第30天极显著升高（P<0.01）;试验组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（T-CHO）含量呈逐渐降低的趋势,在第15天和第30天不同程度降低。试验组血清IgG和IgA含量在使用复方中药发酵饲料后逐渐升高,在第30天极显著高于对照组（P<0.01）;试验组血清IgM含量略有升高,但未达到显著性差异（P>0.05）。试验组血清干扰素（IFN）-α和IFN-β的含量高于对照组,但仅IFN-α在第30天的含量达到极显著差异（P<0.01）。综上所述,饲喂复方中药发酵饲料可提高母猪机体抗氧化能力,促进机体蛋白质的代谢和吸收,提高母猪的免疫能力。
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猪传染性胃肠炎病毒疫苗株S基因的克隆及其与流行株的比对分析
《畜牧与饲料科学 》 2021
摘要：[目的]分析猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）疫苗株和流行株S基因的遗传变异特征。[方法]利用RT-PCR方法对国内目前广泛使用的TGEV疫苗株A、B、C的S基因进行克隆并测序,将获得的序列与近年来公开发表的分离自不同地区的TGEV毒株S基因序列进行比对分析;选取NCBI中登录号为AF104420.1-Britain、AY587882.1-Nanjing、DQ811786.2-America、EU074218.2-Harbin、FJ755618.2-Harbin、JQ700304-fuzhou、KC609371.1-Shanghai、KX900411.1-United States、M94099.1-Spain和MK272773.1-Fushun的TGEV流行株S基因序列,与疫苗株A、B、C的S基因序列一起,利用MegAlign软件进行比对分析。[结果]疫苗株A、B、C的S基因序列两两间的同源性均在96.7%以上;疫苗株A、B、C的S基因序列与NCBI中流行株S基因序列的同源性分别在94.43%～99.82%、95.30%～99.64%、93.48%～98.38%;由遗传进化树可知,疫苗株A、C与国外流行株M94099.1-Spain在同一分支上,疫苗株B与国内流行株JQ700304-fuzhou在另一分支上。[结论]TGEV疫苗株的S基因与流行株同源性较高,变异性不大。
关键词： 猪传染性胃肠炎病毒 疫苗株 流行株 S基因 遗传变异
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鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析
《中国动物传染病学报 》 2021
摘要：从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、QX等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%;用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF雏鸡,对雏鸡的致死率为41.6%,感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。感染鸡从感染后第2 d开始持续向外界排毒直至感染后28 d。该研究数据表明,从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX型的IBV,该毒株对雏鸡有较强的致病作用,研究结果为了解该地区IBV的流行情况提供了参考数据。
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 合肥分离株 S1基因序列分析 致病性
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