科研产出
水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用
《中国兽医科学 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病.本研究针对AIV-H9、GoCV和MDRV的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了这3种病毒的多重PCR检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证.结果显示,建立的三重PCR检测方法能特异性扩增AIV-H9、GoCV和MDRV的 目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒4型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93× 104 copies/μL、2.5× 102 copies/μL、3.0× 106 copies/μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为6.7%,GoCV和AIV-H9的检出率较高,分别为36.7%和26.7%.三重PCR与单重PCR的符合率为100%.结果表明,该三重PCR检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这3种病毒的流行病学调查和临床检测.
关键词： 禽流感病毒H9亚型 鹅圆环病毒 番鸭呼肠孤病毒 三重PCR
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安徽部分地区鸡场鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体感染与垂直传播调查
《中国家禽 》 2024 北大核心
摘要：为了解安徽部分地区规模鸡场鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）流行感染情况，试验采集21家鸡场鸡血液样品进行血清学调查，并对3家种鸡场的种鸡群及其后代雏鸡进行MG和MS的病原检测，分析种鸡及其后代雏鸡的感染情况。结果显示，MG和MS的鸡场血清阳性率分别为95.24%和90.48%，鸡群平均血清阳性率分别为75.08%和77.01%；商品蛋鸡和种鸡的MG和MS血清阳性率高于育雏育成鸡；鸡群日龄越大，MG和MS的血清阳性率越高，其中300日龄以上鸡群的血清阳性率均为100%。病原检测发现，种鸡场存在不同程度的MG和MS感染，其中MS感染率高于MG；种鸡感染率与其后代雏鸡的垂直感染存在显著正相关，并且在垂直感染的雏鸡关节组织检测出MS病原。结果表明，MG和MS在安徽鸡场中的感染较为严重，垂直传播是雏鸡早期感染的重要途径，并且MS在雏鸡垂直感染的早期即可侵入关节组织。
关键词： 安徽 规模鸡场 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 血清学调查 垂直传播
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1株新型鹅星状病毒的全基因序列分析
《安徽农业科学 》 2024
摘要：为研究新型鹅星状病毒(Novel goose astroviruses, N-GAstV)的遗传进化特征，获得了鹅星状病毒安徽分离株AstV/AHHX的全长基因，为7 251 nt。测序分析显示：AstV/AHHX具有典型的新型鹅星状病毒基因组特征。AstV/AHHX与分离株GDZJ37以及山东分离株G538和G576的遗传距离较近；同时与毒株GDZJ37、G538和G576的ORF2氨基酸序列同源性达100%,ORF1a和ORF1b的同源性也有99.6%以上，推测它们由同一毒株演化而来。ORF2氨基酸序列位点分析显示有12高变异位点，分别是第36(Y/S/H)、60(V/I)、224(T/A)、228(A/S/T)、229(P/Q)、289(T/A)、376(T/A)、456(D/E)、540(Q/L)、608(S/T)、610(E/D/G)、614(N/A/T)位氨基酸。其中第224、228、229、608、614位的氨基酸突变可能导致病毒蛋白质的构象及功能发生变化，进而改变病毒的致病能力。
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猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立
《安徽农业大学学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量PCR方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通PCR方法进行一致性评价.结果显示,PCV3的标准曲线为Y=–3.534 6 logX+41.11(R2=1.00),PCV4的标准曲线为Y=–3.382 5 logX+40.67(R2=1.00).PCV3和PCV4的检测限分别为49.5和27.1 copies·μL-1.对猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%.临床样品检测结果显示,PCV3阳性检出率为40.8%,PCV4阳性检出率为20.4%,混合感染率为19.0%.建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑.
关键词： 猪圆环病毒3型 猪圆环病毒4型 TAQMAN 实时荧光定量PCR
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安徽六安地区1例鹅圆环病毒病PCR诊断与分析
《安徽农业科学 》 2023
摘要：[目的]对安徽六安某朗德鹅场送检的疑似圆环病毒病的病料进行鉴定.[方法]采集病例中鹅的肝脏,提取病毒DNA,根据Gen-bank已登录GoCV基因序列设计引物,通过PCR检测病料中GoCV,对扩增到的序列进行测序,最后将获得的序列构建进化树进行遗传进化分析.[结果]检测到大小为580 bp的目的条带,序列比对结果发现,鉴定株与山东分离株KT387277.1 的遗传距离最近.[结论]该研究结果为了解该地区GoCV的流行情况提供了参考.
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重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立
《云南农业大学学报(自然科学版) 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型（fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术（recombinase aided amplification,RAA）与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a）技术相结合，针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA （crRNA），利用RAA技术扩增样本核酸，并进行CRISPR-Cas13a荧光检测，以qPCR为对照方法，评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成，反应体系可检测的最低扩增拷贝数为10~1 copies/μL，灵敏度高，且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点，可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。
关键词： 禽腺病毒4型 CRISPR/Cas13a 重组酶辅助扩增 检测
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六安地区猪细小病毒流行病学调查
《养猪 》 2023
摘要：为了解六安地区猪细小病毒(PPV)感染和毒株变异情况,采用荧光PCR对2022 年3~4 月采集自六安地区 11 家规模猪场 185 份血清样本进行检测,并对阳性样本进行PPV VP2 基因的扩增和分析.结果显示,当前六安地区猪群中PPV感染较为普遍,总体样本阳性率为23.2%(43/185),猪场感染率为 45.45%(5/11),感染猪场的样品阳性率为10%~100%;自5 家阳性猪场扩增的PPV VP2 基因序列完全相同,与参考毒株均具有较高的序列同源性(94.8%~98.8%)和较近亲缘关系.本研究为六安地区猪细小病毒病防控提供了参考和依据.
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猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用
《畜牧兽医学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(por-cine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法.针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性.结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL-1,且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应.采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881.本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段.
关键词： 猪流行性腹泻病毒 CRISPR/Cas13a 重组酶辅助扩增 N基因 检测
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番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析
《中国兽医杂志 》 2022 北大核心
摘要：为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征,本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因,并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对.序列分析显示,克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因,分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高,而NS基因则较为保守;进化分析显示,安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支,二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近,可能来源于同一毒株,与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远;安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致.两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高,与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH 1401同源性也在99.5%以上;与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低,其中VP基因仅为88.9%、89.3%.本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高,但仍存在一定程度的基因变异,增加了诊断与防控该病的难度.
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猪流行性腹泻病毒N-E.coli OmpA融合基因构建、表达及其免疫原性评价
《养猪 》 2022
摘要：为获得免疫原性更强的猪流行性腹泻病毒（PEDV）结构蛋白，试验将PEDV N蛋白基因和大肠杆菌（E.coli）OmpA蛋白基因进行融合，采用柔性linker联接，得到OmpA-linkerPEDV N融合基因，并克隆至pCold I质粒，构建重组质粒p Cold I-OmpA-linker-PEDV N。重组质粒转入BL21感受态细胞，SDS-PAGE分析重组质粒的表达，并对其编码的融合蛋白进行二级和三级结构预测。Western-blot和ELISA分析融合蛋白的免疫原性。结果表明：构建了融合基因表达质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N，表达了约88 ku的融合蛋白；融合蛋白的二级结构未发生明显变化，三级结构预测可折叠为正确的空间构像。该融合蛋白同时具有PEDV N蛋白和OmpA蛋白的免疫原性，并且其免疫原性显著高于单一PEDV N蛋白。说明试验获得了免疫原性较好的融合基因表达蛋白，可以为PEDV N蛋白功能研究、特异性抗体制备以及PEDV亚单位疫苗的研制提供材料和研究基础。
关键词： PEDV N基因 E.coli OmpA基因 基因融合 基因表达 免疫原性
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