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猪流行性腹泻病毒N-E.coli OmpA融合基因构建、表达及其免疫原性评价
《养猪 》 2022
摘要：为获得免疫原性更强的猪流行性腹泻病毒（PEDV）结构蛋白，试验将PEDV N蛋白基因和大肠杆菌（E.coli）OmpA蛋白基因进行融合，采用柔性linker联接，得到OmpA-linkerPEDV N融合基因，并克隆至pCold I质粒，构建重组质粒p Cold I-OmpA-linker-PEDV N。重组质粒转入BL21感受态细胞，SDS-PAGE分析重组质粒的表达，并对其编码的融合蛋白进行二级和三级结构预测。Western-blot和ELISA分析融合蛋白的免疫原性。结果表明：构建了融合基因表达质粒pCold I-OmpA-linker-PEDV N，表达了约88 ku的融合蛋白；融合蛋白的二级结构未发生明显变化，三级结构预测可折叠为正确的空间构像。该融合蛋白同时具有PEDV N蛋白和OmpA蛋白的免疫原性，并且其免疫原性显著高于单一PEDV N蛋白。说明试验获得了免疫原性较好的融合基因表达蛋白，可以为PEDV N蛋白功能研究、特异性抗体制备以及PEDV亚单位疫苗的研制提供材料和研究基础。
关键词： PEDV N基因 E.coli OmpA基因 基因融合 基因表达 免疫原性
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番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析
《中国兽医杂志 》 2022 北大核心
摘要：为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征,本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因,并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对.序列分析显示,克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因,分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高,而NS基因则较为保守;进化分析显示,安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支,二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近,可能来源于同一毒株,与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远;安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致.两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高,与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH 1401同源性也在99.5%以上;与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低,其中VP基因仅为88.9%、89.3%.本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高,但仍存在一定程度的基因变异,增加了诊断与防控该病的难度.
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复方中药发酵饲料对母猪繁殖性能、血清生化指标和肠道菌群的影响
《中国畜牧杂志 》 2021 北大核心
摘要：为研究复方中药发酵饲料对母猪繁殖性能、血清生化指标和肠道微生物菌群的影响,本试验选取20头经产母猪分为对照组和试验组,每组10头。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中加入20%的复方中药发酵饲料。对试验组和对照组的平均窝产活仔数、平均窝产弱仔率和仔猪腹泻率进行分析;在第0、15、30天测定2组母猪的血清生化指标,在第15天采集母猪粪便样品,测定微生物菌群变化。结果显示:与对照组相比,试验组母猪的平均窝产活仔数增加（P>0.05）,平均窝产弱仔率（P>0.05）和仔猪平均腹泻率（P<0.05）降低;与对照组相比,试验组血清总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶和过氧化氢酶含量在第15天和30天均升高（P<0.01）;试验组血清丙二醛、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量在第15天和30天均显著或极显著低于对照组;饲喂复方发酵中药饲料可提高母猪的肠道微生物多样性和稳定性（P>0.05）,并且可显著提高克里斯滕森氏菌属R-7群、乳杆菌属、瘤胃菌科UCG-002、拟杆菌属等有益菌的相对丰度,显著降低密螺旋体属2、链球菌属、副拟杆菌属和大肠杆菌-志贺氏菌属等菌群的丰度。综上所述,饲喂复方中药发酵饲料可提高母猪的繁殖性能,提高机体抗氧化能力,改善母猪的肠道菌群结构。
关键词： 复方中药发酵饲料 母猪 繁殖性能 血清生化指标 肠道菌群
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GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立
《安徽农业科学 》 2021
摘要：[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）和禽腺病毒血清4型（FAdV-4）3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒（DFV）、鸭I型肝炎病毒（DVH-Ⅰ）和禽呼肠孤病毒（ARV）;GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。
关键词： 鹅细小病毒（GPV） 番鸭细小病毒（MDPV） 禽腺病毒4型（FAdV-4） 三重PCR检测
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复方中药发酵饲料对母猪血清生化指标和免疫机能的影响
《养猪 》 2021
摘要：为研究复方中药发酵饲料对母猪血清生化指标和免疫机能的影响,研究选取20头经产母猪随机分为对照组和试验组,每组10头,对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中加入20%的复方中药发酵饲料。在第0天、第15天和第30天分别采集两组母猪的血清,测定血清生化指标和免疫指标。结果显示,与对照组相比,试验组血清总抗氧化能力（T-AOC）极显著升高（P<0.01）;血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量在第15天和第30天极显著升高（P<0.01）;试验组血清甘油三酯（TG）和总胆固醇（T-CHO）含量呈逐渐降低的趋势,在第15天和第30天不同程度降低。试验组血清IgG和IgA含量在使用复方中药发酵饲料后逐渐升高,在第30天极显著高于对照组（P<0.01）;试验组血清IgM含量略有升高,但未达到显著性差异（P>0.05）。试验组血清干扰素（IFN）-α和IFN-β的含量高于对照组,但仅IFN-α在第30天的含量达到极显著差异（P<0.01）。综上所述,饲喂复方中药发酵饲料可提高母猪机体抗氧化能力,促进机体蛋白质的代谢和吸收,提高母猪的免疫能力。
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猪流行性腹泻病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立
《安徽农业科学 》 2020
摘要：为建立检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgG抗体的间接ELISA方法,以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒为包被抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了2种检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法.结果显示,纯化全病毒和重组N蛋白抗原的最佳包被浓度分别为1.00和4.92μg/mL,检测样品最佳稀释度分别为1∶100和1∶50,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性血清的最低检测稀释倍数分别为1∶1 600和1∶800,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒等阳性血清均无交叉反应性,2种方法对临床样品检测符合率为95.92%.这表明2种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价血清中特异性PEDV IgG抗体.
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仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究
《中国畜牧兽医 》 2020 北大核心
摘要：本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系,为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的相关研究提供材料.研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体,采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离.采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化;比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响;MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性;免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况.结果显示,本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞,具有明显的"S"型细胞增殖曲线.通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞,同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性.弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示,两者并没有明显区别,这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路.免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞,并在其中进行复制增殖.本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法,该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料.
关键词： 仔猪小肠上皮细胞 体外培养 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 增殖活性 细胞传代
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6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析
《畜牧与饲料科学 》 2019
摘要：为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便(2013—2017年);对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析.结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62.核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%.其中,5株PEDV分离株(N12、N22、N32、N52和N62)与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株(LZC、CHS)的同源性较低(94.1%~96.3%),亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性(96.9%~99.2%),亲缘关系较近;而N42正好相反.该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主.
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流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析
《养猪 》 2019
摘要：为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的遗传变异,试验对5株PEDV安徽流行毒株S基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果显示,5株PEDV安徽流行毒株S基因的全长均为4 161 bp,编码1 386个氨基酸,核苷酸同源性为98.7%～99.8%,它们与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株亲缘关系较近。研究结果可为PEDV的防控和疫苗研制提供参考和依据。
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猪流行性腹泻免疫抗体的ELISA检测 及其与琼脂扩散试验相关性分析
《养猪 》 2019
摘要：为了解不同免疫程序对母猪初乳中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平的影响,以及PEDV抗体的ELISA与琼脂扩散试验(琼扩试验)检测相关性,选取5家免疫程序不同的大型猪场,用PEDV IgA抗体ELISA检测试剂盒对其初乳抗体水平进行检测,并根据检测结果,选OD值大小不同的5组初乳样本,琼扩法检测其PEDV抗体效价并分析.结果显示,5家猪场初乳PEDV IgA抗体阳性率均较高,阳性率为94.00%~100%,阳性样本平均OD值为1.8588~2.1480,差异不显著;PEDV抗体琼扩几何平均效价与ELISA检测的OD值存在正相关性.分析表明,母猪产前进行猪流行性腹泻活疫苗和灭活苗各一次的组合免疫较为合理;对PEDV抗体检测琼扩法一定程度上可做为ELISA法的替代.
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