仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究

沈学怀; 翟银建; 尹磊; 潘孝成; 张丹俊; 赵瑞宏; 戴银; 胡晓苗; 周学利; 侯宏艳; 《中国畜牧兽医 》 2020 北大核心

摘要：本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系,为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的相关研究提供材料.研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体,采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离.采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化;比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响;MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性;免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况.结果显示,本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞,具有明显的"S"型细胞增殖曲线.通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞,同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性.弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示,两者并没有明显区别,这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路.免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示,PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞,并在其中进行复制增殖.本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法,该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料.

关键词： 仔猪小肠上皮细胞 体外培养 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 增殖活性 细胞传代